Der fantasievolle Larry Daley braucht dringend einen festen Job, weil seine Exfrau ihm sonst den Umgang mit seinem Sohn untersagt. Aus der Not heraus nimmt er einen Nachtwächterjob im New Yorker Naturkundemuseum an. Der langweilige Job stellt sich als aufregendes Abenteuer heraus, als die Gegenstände im Museum in der Nacht ein fantastisches Eigenleben entwickeln. Bei Dinosaurierskeletten und antiken Kriegern muss Larry sein diplomatisches Geschick unter Beweis stellen.